【前言】

小细胞外囊泡（sEVs）是由几乎所有细胞类型释放的脂质膜包裹的纳米颗粒，通常范围从20到200纳米，通过传递各种信号分子和细胞成分（如蛋白质、脂质、核酸和代谢物）在细胞间通信中发挥关键作用。小细胞外囊泡（sEVs）作为无细胞治疗的新方向，在疾病治疗中展现出巨大潜力。然而，使用sEVs作为疾病治疗剂的普及受到来源细胞增殖潜力的限制，特别是如果亲本细胞寿命有限，从临床前测试到临床应用，规模化工艺是一大难点。

细胞工艺培养方式主要分为二维（2D）培养和三维（3D）培养。3D培养更真实地再现了细胞与细胞之间以及细胞与胞外基质之间地相互作用，更准确地模拟细胞在组织中的实际微环境。且3D培养方式更易于规模化生产，可实现产业化。

        细胞贴附在3D TableTrix® 微载体上进行三维培养

与传统的二维（2D）细胞培养相比，三维（3D）培养系统可以使MSC处于代谢有利的状态，从而提高增殖活性、干细胞特性、旁分泌功能以及衰老和凋亡的保护。已有相关文献证明3D培养可以增强细胞分泌小细胞外囊泡（sEVs）。然而，驱动sEV分泌并影响其治疗疾病潜力的分子机制尚未阐明。

近日，Journal of Extracellular Vesicles（IF=14.5）在线发表了一篇题为“Cortical Actin Depolymerisation in 3D Cell Culture Enhances Extracellular Vesicle Secretion and Therapeutic Effects”的研究论文，该研究首次阐明3D培养通过ITGA1/RhoA/cofilin依赖的肌动蛋白解聚增强sEV分泌及治疗功能的新机制，该机制独立于经典的Rab27A/B通路。这一发现为干细胞来源sEV的规模化生产与临床转化提供理论依据。

原文链接：http://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.70109

【研究背景】

当前的研究，3D培养方式主要包括复合聚合物支架培养、微球静态培养、生物反应器动态培养等方式。其中，3D细胞培养系统---生物反应器和细胞球体，已成为大规模EV生产的平台，提供反映体内生理条件和机械刺激的3D环境，以增强细胞反应和EV分泌。

3D FloTrix® miniSPINFLEX生物反应器

该研究通过将MSCs加载到微载体上并在3D旋转瓶生物反应器中培养这些构建体，创建了3D培养条件。对比2D培养条件，3D FloTrix® miniSPIN FLEX生物反应器动态培养方式对sEVs分泌和疾病治疗效果的影响，为干细胞来源sEV的规模化生产与临床转化提供理论依据。

【研究设计】

研究采用3D FloTrix® miniSPIN FLEX生物反应器培养MSCs，在体外细胞模型中，检测sEVs在不同培养系统中分泌的效果、细胞增殖能力、细胞愈合能力以及对巨噬细胞的极化影响。在体内动物模型中，验证3D培养的sEVs对骨关节炎（OA）和大鼠伤口愈合等疾病的处理效果。

【研究内容】

▲A. 3D增殖能力强：MSC-2D在3天后停止增殖，而MSC-3D在7天内继续增殖；

▲B. 3D-sEVs产量高：MSC3D-sEVs的产量大约是MSC2D-sEVs的2.5倍；

▲C. 3D衰老比例低：与MSC-2D相比，MSC-3D的衰老细胞比例明显较低；

▲D. 3D凋亡比例低：与MSC-2D相比，MSC-3D的凋亡细胞的比例明显较低；

▲E. 3D-sEVs改善骨关节炎：与MSC2D-sEVs组相比，MSC3D -sEVs组软骨表面更光滑；

▲F. 3D-sEVs加速伤口愈合：与其他组比较，MSC3D-sEVs组显示出所有组中最快的伤口愈合率。

【研究结论】

研究采用3D FloTrix® miniSPIN FLEX生物反应器培养MSCs，结合基因敲低、免疫荧光及动物模型等方法，发现3D培养通过下调整合素α1（ITGA1）抑制RhoA/cofilin信号通路，诱导皮质肌动蛋白解聚，解除其对多囊泡体与细胞膜融合的物理屏障，使sEV分泌量提升2.5倍，并且证实3D培养的调控机制独立于Rab27A/B。

功能验证显示，3D培养的sEVs（MSC3D-sEVs）在体外可促进软骨细胞/成纤维细胞增殖迁移、抑制细胞衰老，并诱导巨噬细胞向抗炎M2型极化；在大鼠骨关节炎和伤口愈合模型中，MSC3D-sEVs显著改善关节间隙、加速伤口愈合，为骨关节炎、组织损伤等慢性疾病的无细胞治疗提供了从机制到应用的可转化技术路径，为sEV规模化生产与临床转化奠定了理论基础。

【研究应用材料及设备】

① 更仿生：由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率>90%，粒径大小可控于50-500μm区间， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培养。 ② 资质全：该产品已获得2项CDE药用辅料资质，登记号为【F20200000496；F20210000003】，3项FDA原料药及药用辅料资质，登记号为【DMF：037798、035481；MF：29721】 ③ 易收获：特异性降解技术裂解微载体，收获相较于传统方式更高效更温和。 ④ 更安全：拥有权威机构出具的裂解残留检测、细胞毒性、热原反应、遗传毒性、体内免疫毒理学相关质量评价报告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主动全身过敏性、腹腔注射给药毒性等安全性评价报告。 ⑤ 易放大：通过3D培养方式，结合DB视讯 生物3D细胞智造平台全线产品可以实现全自动封闭式大规模细胞培养，实现千亿量级细胞收获。 ⑥ 更优质：通过3D多孔可降解微载体+ 动态培养技术，进行三维培养，优势显著——培养细胞体积更小、迁徙能力更强，同时具备更卓越的免疫调节和组织修复潜能。

① 超薄设计：超薄主机高度仅48mm，扁平化设计可进一步提高培养箱空间利用率。 ② 不锈钢机身：主机采用全不锈钢设计，易清洁好擦拭，满足洁净需求。 ③ 适配一次性反应瓶：适配DB视讯 自研透气内置叶轮一次性反应瓶。其中，搭配125/250ml透气内置叶轮一次性反应瓶，可在一台170L培养箱放置2台设备，实现共8个瓶位的培养体系。 ④ 同步关联：开启关联功能，并结合配方工艺的使用，可将多个瓶位统一工艺模式，一键操作即可实现多瓶位同步启动/暂停/停止，高效完成对照试验。 各瓶位间也可任意关联操作，如图示：瓶位1、瓶位2、瓶位3使用工艺一关联，达到三个瓶位同步运行的效果。 ⑤ 工艺预设：配备十种配方工艺和四种自定义工艺，共计两类步骤模式，满足多步骤、多循环工艺需求。 参数可修改，断电可保存，单步骤时间最高可达1000min,循环次数高达100次，操作便捷。 ⑥ 可编程工艺：搅拌程序可编程、参数自定义。满足间速模式／双速模式／间恒速模式不同工艺需求，实现工艺条件的探索和优化。 ⑦ 双语系统：系统支持中英文双语，一键切换，灵活便捷。 ⑧ 实时信息：系统实时显示每个瓶位的工艺参数：时间、转速、工艺、步骤等。

【关于DB视讯 】

北京DB视讯 生物科技有限公司成立于2018年，由清华大学生物工程学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。核心技术源于清华大学科技成果转化，并凭借此项技术荣登中国科协“科创中国”先导技术榜。作为国家级高新技术企业、国家级专精特新“小巨人”企业、潜在独角兽企业，更获得国家科技部多项重点研发专项支持。

作为高质量三维细胞制造专家，DB视讯 生物提供基于3D微载体的一站式定制化细胞规模化扩增整体解决方案，打造了原创3D细胞智造平台，实现规模化、自动化、智能化、密闭式的细胞药物及其衍生品生产制备，以此帮助全球客户建立最为先进的细胞药物生产线。在开创【百亿量级】干细胞制备工艺管线后，加速向【千亿量级】进发，致力于以3D细胞规模化智造技术赋能细胞与基因治疗产业，惠及更多患者。